Pobieranie materiału
Aby oddać próbkę do badania w naszym laboratorium, należy pobrać materiał badawczy. Najpierw trzeba się zorientować, z jakiego miejsca powinien być on pobrany. W tym celu warto skontaktować się z lekarzem weterynarii lub pracownikami laboratorium, ponieważ może to zależeć od rodzaju planowanych testów. Pobrany materiał powinien zostać umieszczony w suchym oraz szczelnie zamkniętym pojemniku. Nie wolno go długo przechowywać, gdyż po pewnym czasie może już nie nadawać się do badania. Z tego powodu należy go jak najszybciej dostarczyć do laboratorium. Do tego czasu zalecamy trzymanie próbki w chłodnym miejscu, najlepiej w lodówce.
Próbki, które można oddać do badania:
kał, wymazy z odbytu
bardzo użyteczny materiał badawczy zarówno w badaniach parazytologicznych, jak i określeniu nosicielstwa salmonelli. Z powodzeniem izoluje się i inne drobnoustroje jak, chociażby E.coli, Campylobacter, Clostridium. W kale mogą znajdować się również toksyny Clostridium i co ciekawe mikotoksyny. Jest to doskonały materiał do badań na obecność krętków Brachyspira oraz Lawsonia (obecna nawet u ptaków, częsta u koni czy szynszyli).
Do badania potrzebne jest minimum 5 g kału, jeżeli to możliwe należy pobierać go bezpośrednio z odbytu. Materiał trzeba schłodzić (spowolnienie sporulacji), ale nie wolno go mrozić, bo może to spowodować niezdatność do badań parazytologicznych.
- w przypadku zwierząt towarzyszących – do badań parazytologicznych zaleca się trzykrotne pobieranie próbek,
- w przypadku zwierząt hodowlanych – do badań parazytologicznych zaleca się pobranie do 10% stada:
a. można tworzyć grupy wiekowe lub technologiczne,
b. zaleca się monitorowanie stad 2 x w roku (zwykle wiosna – maj oraz jesień – wrzesień - październik),
c. w badaniach rozpoznawczych zaleca się pobieranie próbek od zwierząt z objawami (różne stany zaawansowania)
d. w okresie prepatentnym – brak obecności jaj.
- do badań innych niż parazytologiczne próbki kału można, a niekiedy należy mrozić.
krew
można ją pobrać do dowolnego pojemnika czy probówki. Obecnie najczęściej do pobierania krwi używa się tak zwanych wakuetek, czyli probówek z próżnią, adapterem oraz specjalnymi igłami. Pozwalają one na jałowe pobranie krwi, ale także płynów stawowych, wysiękowych.
- krew w probówkach na skrzep: do wszelkiego rodzaju badań serologicznych, PCR czy biochemicznych. Minimalna objętość próbki zależy od liczby kierunków badań. Jedno badanie to zwykle 10 μl surowicy. Próbki krwi jednak nie powinny być mniejsze niż 1,5 ml. Pozwala to na zachowanie materiału, także na ewentualne rozszerzenie zakresu badań – bez konieczności powtórnego pobierania próbek,
Istotna uwaga - ostatnio rozpowszechniły się probówki plastikowe z dołączoną igłą. Nie są one szczelne i podczas transportu surowica wycieka (co dyskwalifikuje całą serię w przypadku badań technikami PCR). Do dłuższego transportu lepiej nadają się próbówki zamykane korkami.
- krew w probówkach z EDTA: do badań morfologicznych, a także do technik PCR. Ważna sprawa – po pobraniu należy delikatnie, ale dokładnie wymieszać krew (nie wstrząsać) tak, aby nie tworzyły się skrzepy. Jeżeli jest przeznaczona do morfologii, to w ciągu 6 h powinna znaleźć się w laboratorium (temperatura minimalna to 70C a maksymalna 250C). Natomiast jeśli celem jest badanie w technice PCR – trwałość próbek wynosi do 6 dni, ale nie należy dopuścić do hemolizy (nie przegrzewać ani nie mrozić),
- krew heparynizowana: przeznaczona w zasadzie do badań cytogenetycznych, ale czasem też do badań morfologicznych (nasze laboratorium wykonuje analizy przy użyciu analizatorów hematologicznych – do badań hematologicznych przesyłamy krew tylko na EDTA!), rzadko do badań serologicznych czy biochemicznych (enzymy, pośrednio Se). Objętość min. 3 ml. Ważna sprawa – należy delikatnie, ale dokładnie wymieszać krew (nie wstrząsać), żeby nie tworzyły się skrzepy. Badanie cytogenetyczne opiera się o hodowlę limfocytów, zatem dostarczona krew musi zawierać żywe komórki zdolne do namnażania. Czas transportu nie powinien przekraczać 24h, temperatura minimalna to 70C, a maksymalna 250C. W warunkach zimowych i tropikalnych przesyłka wymaga szczególnej troski,
- rozmaz z krwi: niekiedy najlepiej sporządzić rozmaz w lecznicy czy nawet w terenie. Nie jest to trudne. Wystarczą dwa szkiełka podstawowe i wykonanie bardzo nierównego rozmazu z kropli krwi (zmiany w morfologii krwinek, a także pasożyty krwi np. babeszjoza, eperytrozoonoza inaczej Mycoplasma suis – pewniejsze rozpoznanie w technice PCR).
mleko
w tym przypadku szczególnie ważny jest sposób pobrania próbki:
- nie należy brać kilku pierwszych strumieni mleka - w kanale strzykowym drogą wstępującą dochodzi niekiedy do zasysania zanieczyszczeń,
- probówka lub pojemnik muszą być suche i jałowe. Nie należy pozostawiać ich otwartych, w powietrzu unosi się wiele bakterii oraz zarodników grzybów,
- jedna ćwiartka to jedna próbka – nie wolno ich mieszać, nawet jeśli pochodzą od tej samej krowy,
- najlepszym materiałem jest próbka pobrana z ćwiartki, w której pojawił się świeży stan zapalny. Dobrym materiałem jest także mleko pobrane z ćwiartek, w których stwierdza się podwyższone ilości komórek somatycznych (test tackowy),
- w zasadzie unika się poboru próbek z ćwiartek po leczeniu lub w trakcie (nawet po upływie okresu karencji). W trakcie podawania leku dochodzi do sukcesji drobnoustrojów, czyli ich selekcji z pojawianiem się oportunistycznych, często niemających żadnej pierwotnej roli w tworzeniu się stanów zapalnych,
- podobnie jak w każdych badaniach bakteriologicznych najlepszym rozwiązaniem jest systematyczny pobór próbek z monitorowaniem gatunków patogenów i określaniem lekowrażliwości.
Przy posiadaniu wiedzy o lekowrażliwości w stadzie - w przypadku pojawienia się stanów klinicznych istnieje możliwość natychmiastowego zastosowania nacelowanego terapeutyka, a nie prób leczenia w ciemno.
- próbki powinny być dostarczane możliwie szybko, należy je mrozić.
mocz
przy jego pobieraniu należy zawsze pamiętać o opcji badań bakteriologicznych, a zatem zachować jałowość. Czas dostarczenia ma wpływ na wynik pH oraz osadu.
nasienie
tylko dostarczenie nasienia mrożonego (buhaj) lub konserwowanego (knur) umożliwia badanie ruchu oraz jego charakter. Do badań bakteriologicznych nasienie należy schłodzić, a jeszcze lepiej zamrozić. Zamrożenie nie przeszkodzi również w badaniach morfologicznych, pH.
pasze
opakowania, w których przechowywane są pasze, powinny być trwałe i do tego przeznaczone. Próbki można swobodnie przesyłać dowolną drogą, ale należy zwrócić uwagę, aby nie doszło do rozerwania torebki. Temperatura przy krótkim transporcie nie ma decydującego znaczenia. Jednak jełczenie, rozwój bakterii, grzybni, tworzenia mikotoksyn zachodzi w sposób ciągły, dlatego przy dłuższych transportach próbki należy przynajmniej schłodzić. Zamrożenie również jest dopuszczalne.
W polskim prawodawstwie w większości brak norm na parametry jakości paszy. Decyduje wiedza lekarska i przepisy ogólne o dopuszczeniu produktu spożywczego.
- zlecenie może obejmować badania mikrobiologiczne np. pod kątem obecności Salmonella, Clostridium (badanie jakościowe), inne lub OLD (ogólna liczba drobnoustrojów- badanie ilościowe) oraz badania na obecność mikotoksyn.
* Temperatura przechowywania i transportu ma istotne znaczenie na wynik badania.
próby środowiskowe
Po prawidłowej dezynfekcji nie powinno stwierdzać się obecności bakterii z grupy Enterobacteriaceae (np. E.coli).
Aspergillus, Penicylium – grzyby pleśniowe, wytwarzające mikotoksyny, które w głównej mierze są immunosupresorami. Aspergillus - głównie udział w patologii układu oddechowego drobiu.
Fusarium – grzyb pleśniowy, w głównej mierze producent mikotoksyn. Przy wysokim skażeniu środowiska grzyby pleśniowe łatwo pasażują się na pokarm, ściółkę itp., gdzie szybko się namnażają (psucie paszy, mikotoksyny, immunosupresja itp.)
Cladosporium – to grzyb pleśniowy powodujący tworzenie się nadwrażliwości. U ludzi jest przyczyną wielu przypadklów alergii.
Mucor – grzyb pleśniowy, szeroko rozpowszechniony w środowisku. Nie opisuje się go jako patogen.
Candida – drożdżak. Może stać się ważnym patogenem (przewód pokarmowy, pochwa, wole).
W badaniu skuteczności zabiegu dezynfekcji w halach produkcyjnych zwraca się uwagę na szczeliny, załamania, rury. Zwykle na powierzchniach płaskich (ściany, karmidła, sprzęt) nie stwierdza się ich obecności, ponieważ stosunkowo łatwo zmywa się je i dezynfekuje. Obecność E.coli w szczelinach czy rurach zwykle wynika z ich niedomycia.
Nawet najlepszy preparat dezynfekcyjny nie przebije się przez warstwę odchodów, ściółki, kurzu itp. E.coli jest uważany za wskaźnik, jeżeli przeżywa ta bakteria, przeżyć mogą i inne (w tym wysoce patogenne np. Salmonella, ORT, Bordetella etc.). Z doświadczeń wynika, iż jeżeli stwierdza się > 1,0x105jtk/wymaz (szczeliny) to świadczy o niestaranności zabiegu (zwykle przy wysokim zużyciu obiektu).
surowica
wykorzystywana jest do badań serologicznych, PCR, HPLC i biochemicznych. Podczas przetrzymywania krwi pełnej stopniowo dochodzi do rozpadu erytrocytów, znacznie szybciej zachodzi to w temperaturach poniżej 40C (przemrożenie spowoduje całkowitą hemolizę) oraz powyżej 250C. Do dłuższego transportu najlepiej odseparować jak najszybciej surowicę od skrzepu (zwłaszcza dla badań biochemicznych), z przeniesieniem jej do oddzielnych probówek, najlepiej typu Eppendorf.
- surowica do badań serologicznych, PCR: we współczesnych technikach serologicznych bez znaczenia jest nieznaczna hemoliza. Nie wpływa ona na wynik końcowego badania. Jednak całkowita hemoliza zniekształca wyniki, a nawet uniemożliwia przeprowadzenie badania. Trzeba to brać pod uwagę podczas przygotowywania próbek do transportu (chłodziwo nie może być zamrożone lub powinno być odizolowane od bezpośredniego kontaktu z krwią). Do badań serologicznych można, a nawet zaleca się przesyłanie surowicy. Podczas krótkiego transportu (czas i temperatura) nie ma potrzeby szczególnego zabezpieczania krwi pełnej.
Przygotowanie surowicy do badań serologicznych: oddzielenie surowicy od skrzepu można wykonać w każdych warunkach bez konieczności posiadania wirówki czy pipet. Po pobraniu krwi pozostawia się ją na 3-4 godziny w temperaturze pokojowej. W tym czasie dojdzie do wydzielenia się surowicy. Wystarczy ją zlać, odpipetować lub odciągnąć strzykawką do innej probówki (np. Eppendorf), zamrozić i wysłać.
- do badań biochemicznych: surowica nie może mieć nawet śladów hemolizy. Jeżeli to możliwe - krew po pobraniu należy w ciągu 6 godzin dostarczyć do laboratorium – najlepiej schłodzoną (~ 70C), ale w żadnym przypadku zamrożoną. Jeżeli dostarczenie próbki do laboratorium w tak krótkim czasie nie jest możliwe, należy pozyskać surowicę.
Przygotowanie surowicy do badań biochemicznych: krew po pobraniu pozostawić na 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. Jeżeli nie doszło do wytworzenia się czystej klarownej surowicy, zaleca się ją odwirować ~ 1000 rpm przez 10 minut. Surowicę należy odciągnąć pipetą lub strzykawką i przenieść do innej probówki (najlepiej typu Eppendorf), zamrozić, a następnie wysłać.
*Jeżeli brak wirówki – krew pozostawić w temperaturze pokojowej na 3-4 godziny. Po wykrzepieniu ostrożnie odciągnąć surowicę pipetą lub strzykawką. Nie wolno przelewać.
UWAGA: surowicę do badań biochemicznych odciąga się pipetą lub strzykawką, nie należy jej zalewać – podczas zlewania pewna część erytrocytów, krwinek białych dostaje się do surowicy i podczas mrożenia dochodzi do ich lizy.
Najczęściej stosowane techniki (ELISA) pozwalają przeprowadzić kilka badań posiadając 10 μl surowicy (mniej niż pół kropli). Mimo to zaleca się, aby objętość surowicy wynosiła nie mniej niż 0,5 ml. Pozwoli to na jej zachowanie, a z drugiej strony przy niewielkich objętościach surowicy, może dojść do odparowania i zagęszczenia próbki. Ponadto niektóre techniki serologiczne (AGP, HI, aglutynacja płytowa) wymagają większych objętości (do 100 μl).
Surowica jest dobrą, a niekiedy niezastąpioną próbką do badań mikotoksykologicznych. Jednak do jednej analizy w technikach HPLC wymagane jest co najmniej 3 ml surowicy. Zwykle sporządza się pulowanie (łączenie) surowic. Prosimy jednak o nadsyłanie ich oddzielnie, w laboratorium przeprowadzimy to w dokładniejszy sposób. W przypadku oznaczania witamin konieczne jest 500 μl surowicy.
Surowice do transportu można mrozić (w tej postaci przechowywać nawet dłużej niż 1 rok). W przesyłkach stosować można zamrożone chłodziwo.
| Lp. | Rodzaj Badania | Uwagi |
|---|---|---|
| 1 | ALT, AST, LDH, GGTP | Surowica lub osocze z heparyną, EDTA, bez hemolizy, 3 dni 2-8 st. C |
| 2 | GLDH, CK | Surowica bez hemolizy, 2 dni 2-80C |
| 3 | ACPT. Fosfataza kwaśna | Surowica, świeża oddzielona od skrzepu w ciągu 2 godz. (7 dni z buforem octanowym w 2-80 st. C). |
| 4 | Fosfataza alkaliczna-ALP | Surowica lub osocze z heparyną, EDTA, bez hemolizy. |
| 5 | Białko całkowite | Surowica lub osocze z heparyną, EDTA. |
| 6 | Glukoza | Surowica, osocze, mocz. Krew na kwas trójchlorooctowy. |
| 7 | Bilirubina całkowita | Surowica bez hemolizy !! 6 godz. chronić przed światłem, osocze z EDTA lub heparyną. |
| 8 | Kwas moczowy | Surowica, osocze, mocz. |
| 9 | Mocznik | Surowica, osocze z EDTA, mocz. |
| 10 | Kreatynina | Surowica, 24 godz. w 2-80 st. C, osocze z EDTA lub heparyną, mocz. |
| 11 | Na, K | Surowica, osocze z heparyną. |
| 12 | Chlorki | Surowica, osocze z heparyną, płyny ustrojowe lub mocz. Trwałe. |
| 13 | Magnez | Surowica, osocze (heparyna) – bez śladów hemolizy, mocz. |
| 14 | Miedź | Surowica lub osocze na heparynę. Bez hemolizy. |
| 15 | Wapń, amylaza, lipaza | Surowica lub osocze (heparyna), mocz. |
| 16 | Żelazo, TIBC, BHB (ciała ketonowe) | Surowica lub osocze z heparyną. |
| 17 | Fosfor | Surowica bez hemolizy oddzielona jak najszybciej od erytrocytów. 1 tydzień w 2-80 st. C, osocze z heparyną, mocz. |
| 18 | Cynk | Surowica lub osocze z heparyną (!!), Bez hemolizy. Mocz., nasienie. |
| 19 | Albuminy, Cholesterol całkowity (TGL, HDL, LDL) | Surowica, osocze z EDTA, heparyną. |
| 20 | Selen (GPX) | Krew pełna na EDTA dostarczona w ciągu 4 h. |
| 21 | Białka ostrej fazy (CRP) | Surowica. |
| 22 | TAS | Surowica, osocze z heparyną, 36 h w 40 st. C, 14 dni w -200 st. C. |
| 23 | WKT (kwasy tłuszczowe) | Surowica lub osocze po 12 h od karmienia. Stabilność przez 4 tyg. w -200 st. C, 02 h w 100 st. C. |
| 24 | hormony (LH, FSH, TSH, kortyzol, estrogeny, progesteron, T3, T4, testosteron, prolaktyna) | Surowica. |
| 25 | Morfologia krwi | Krew pełna EDTA. |
| 26 | Mocz, 10 oznaczeń biochemicznych + osad | Mocz; pH, glukoza, białko, bilirubina, ciężar właśc., keton, azotyny, urobilinogen, krew. |
woda
stanowi ważny element oceny środowiska i wpływu na zdrowotność zwierząt. Jest również istotnym elementem chemioterapii, zwłaszcza przy stosowaniu dozymetrów. Jakość wody informuje o skuteczności leczenia. W wodzie o niekorzystnym składzie wiele ze stosowanych preparatów nie jest rozpuszczalnych, tworzy chelaty (agregaty) zatykające dysze. Preparaty mogą nawet zmieniać swoją aktywność terapeutyczną lub całkowicie ją utracić.
- badania mikrobiologiczne i chemiczne.
Pobór próbek przeprowadza się:
- w miejscu ujęcia,
- w miejscu odpoju (obecność biofilmu, stan rur przesyłowych).
UWAGA: woda wodociągowa z ujęć publicznych nie gwarantuje, że do zwierząt dociera woda o odpowiednim standardzie. Zużycie sieci, biofilny powodują znaczne zmiany jej składu.
wycinki, zwłoki, płyn ustny
zwykle kierowane są do badań bakteriologicznych, PCR, parazytologicznych, ale także toksykologicznych (w tym obecności toksyn bakteryjnych). W naszym laboratorium preferujemy całe zwłoki (jak najświeższe lub po eutanazji w fazie początkowej schorzenia). Umożliwia to właściwe pobranie odpowiednich próbek, ponadto taki materiał jest mniej narażony na zanieczyszczenia wtórne.
- wycinki muszą być pobrane z narządów, w których dochodzi do namnożenia drobnoustrojów (np. APP- płuca, Clostridium – jelita cienkie + wątroba, nerki etc.) lub reprezentować całą gamę narządów tak, aby możliwa była izolacja dowolnych patogenów,
UWAGA: w każdych badaniach rozpoznawczych zaleca się zawsze pobieranie przynajmniej dwóch narządów płuc i jelit.
- powszechnie uważa się, że materiał nie powinien być mrożony, jednak własne obserwacje tego nie potwierdzają. Co więcej, zauważyliśmy, iż niektóre drobnoustroje łatwiej izolować po mrożeniu. W badaniach na toksyny beztlenowcowe (jelita, kał) nawet konieczne jest mrożenie lub przynajmniej schłodzenie w celu zahamowania namnażania pośmiertnego,
- im większe wycinki, tym mniejsze niebezpieczeństwo wtórnego zanieczyszczenia lub przerostu. Najlepiej każdy organ pakować oddzielnie. Obowiązkowo należy schłodzić i przesyłać z chłodziwem.
Materiał można dostarczyć:
- za pośrednictwem kuriera,
- osobiście (lekarz, właściciel),
- przesyłka konduktorska (powiadomić laboratorium o terminie przyjazdu, ewentualnie o numerach rejestracyjnych autobusu),
- za pośrednictwem kuriera z laboratorium (przystosowany pojazd, szybkie dostarczenie do laboratorium, na trasach rejsowych – nieodpłatnie).
zeskrobiny, wymazy
Jeżeli próbki nie da się pobrać w lecznicy, terenie etc., można kierować zwierzę do pobrania w laboratorium. W miarę możliwości próbkę należy pobrać z pogranicza zmian.
- materiał musi być dostarczony do laboratorium jak najszybciej,
- nie wolno dopuścić do wysuszenia próbki. W tym celu dobrze jest używać podłoży transportowych z odpowiednim podłożem lub co najmniej nasyconych solą fizjologiczną,
- można zamrażać (z wyjątkiem badań parazytologicznych).
Wymazy z nosa to bardzo skuteczna metoda pobierania materiału u zwierząt nieleczonych. Sprawdza się zwłaszcza u bydła i zwierząt towarzyszących. U świń – ze względu na budowę kanału oraz behawioryzm – sprawdza się w metodach monitoringowych, grupowych – z końcową analizą PCR.
Technika pobrania odgrywa kluczową rolę. Każdy gatunek – to nieco inne techniki. Jeżeli to możliwe – przed pobranie skłonić zwierzę do kichnięcia za pomocą piórka lub wacika.